Kolesterol dengan kadar yang tinggi dalam pembuluh darah dapat menyebabkan munculnya penyakit atherosclerosis, stroke, serta serangan jantung mendadak. Isolat protein kedelai memiliki peptida bioaktif yang berpotensi sebagai antikolesterol. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kondisi optimum hidrolisis dan mengkarakterisasi peptida bioaktif dari hidrolisat protein kedelai oleh enzim bromelin. Optimasi hidrolisis dilakukan menggunakan enzim bromelin dengan kadar 0,2%; dan 0,5% (b/v) serta variasi waktu inkubasi 0, 1, 2, 3, 4, 5, dan 6 jam pada suhu 45, 50 dan 55 °C. Hidrolisat protein dianalisis derajat hidrolisis (% DH) dan diuji aktivitas antikolesterol melalui uji inhibisi HMG-CoA reductase dengan pravastatin sebagai kontrol positif. Profil hidrolisat protein kedelai dianalisis dengan SDS-PAGE (sodium dodecyl sulphate gel polyacrylamide). Hidrolisat protein yang memiliki aktivitas antikolesterol tertinggi difraksinasi lebih lanjut menggunakan kromatografi gel filtrasi (Sephadex G-10). Fragmen peptida yang dihasilkan dikarakterisasi bobot molekulnya menggunakan LCMS/MS Q-TOF. Hasil penelitian menunjukkan kondisi optimum hidrolisis isolat protein kedelai diperoleh pada waktu 2 jam, suhu 45 °C dengan konsentrasi enzim 0,5% yaitu dengan nilai DH 40,22%. Aktivitas antikolesterol tertinggi didapatkan dari hidrolisat tersebut dengan nilai persen inhibisi 82,80% (7.371 ppm). Hasil analisis SDS-PAGE menunjukkan munculnya pita-pita di bawah 10 KDa dan fragmen peptida hasil fraksinasi memiliki bobot molekul 2779 dan 2609 Da.
Kata kunci: antikolesterol, bromelin, peptida bioaktif, isolat protein kedelai