Gandaria (Bouea macrophylla Griff) adalah salah salah satu tumbuhan asli Indonesia yang mengandung senyawa golongan flavonoid yang dapat dimanfaatkan sebagai sumber senyawa antioksidan. Penelitian ini bertujuan untuk memisahkan, mengkarakterisasi dan menentukan aktivitas antioksidan senyawa flavonoid dari ekstrak metanol batang gandaria (B. macrophylla). Ekstrak metanol batang gandaria diisolasi dengan berbagai metode kromatografi seperti KLT, KVC, KKG, kromatotron dan KLT preparatif dengan silika gel 60 F254 dan silika gel G60 sebagai fasa diam serta berbagai perbandingan pelarut organik sebagai fasa geraknya. Proses pemisahan dipandu dengan pereaksi AlCl3 sebagai penentu pita flavonoid. Hasil pemisahan didapatkan isolat 1 berupa padatan putih bermassa 3 mg. Isolat 1 dikarakterisasi dengan spektroskopi LCMS/MS dan 1H-NMR. Hasil analisis dengan LCMS/MS isolat 1 menunjukkan adanya 1 puncak tunggal pada waktu retensi 5,19 menit dengan berat molekul sebesar 272 g/mol. Hasil analisis 1H-NMR isolat 1 menunjukkan kesesuaian yang tinggi dengan senyawa turunan genistein sehingga isolat 1 disarankan sebagai senyawa 4,5,7,4’-tetrahidroksi-isoflavon. Aktivitas antioksidan ekstrak metanol dan senyawa 4,5,7,4’-tetrahidroksi-isoflavon mempunyai nilai IC50 berturut-turut sebesar 9,11 dan 707,08 ppm.
Kata kunci: 4,5,7,4’-tetrahidroksi-isoflavon, antioksidan, DPPH, flavonoid, gandaria, kromatografi