Pemanfaatan temu ireng sebagai tanaman obat menyebabkan kebutuhannya meningkat, namun tingkat produksinya masih tergolong rendah dibandingkan temulawak dan jahe. Perbanyakan in vitro dengan penambahan sitokinin dan konsentrasi KNO3 diperlukan supaya menghasilkan benih yang banyak dan sehat. Penelitian ini bertujuan untuk memperoleh jenis sitokinin dan konsentrasi KNO3 yang meningkatkan perbanyakan temu ireng secara in vitro, serta menganalisis pengaruh kombinasi antara keduanya. Penelitian menggunakan rancangan acak lengkap faktorial dengan dua faktor, yaitu sitokinin (kinetin, benzyl adenine (BA), benzyl amino purine (BAP), zeatin, thidiazuron (TDZ), dan 2iP) dan konsentrasi KNO3 (0, 800, dan 1.600 ppm). Hasil penelitian menunjukkan bahwa TDZ meningkatkan rata-rata jumlah tunas (2,28 tunas) dibandingkan BA (1,89 tunas), BAP (1,22 tunas), zeatin (1,22 tunas), dan 2iP (1,00 tunas). Kinetin meningkatkan rata-rata tinggi tanaman (10,40 cm) dan kadar klorofil (17,51 unit). Konsentrasi KNO3 800 ppm meningkatkan (Sig