Tingginya kasus penolakan ekspor biji pala (Myristica fragrans Houtt.) ke pasar Uni Eropa (83%) disebabkan kontaminasi aflatoksin yang dihasilkan oleh Aspergillus flavus yang melebihi ambang batas. Upaya pengendalian A. flavus dengan pemanfaatan kapang endofit nonpatogen sebagai agen hayati yang aman perlu dilakukan. Penelitian ini bertujuan untuk memperoleh dan mengetahui jenis isolat kapang endofit dari tanaman pala yang mampu menghambat A. flavus secara in vitro dengan sifat nonpatogen terhadap manusia, hewan dan tumbuhan. Metode yang digunakan adalah ekplorasi dengan isolasi kapang endofit dari tanaman pala dan ekperimental dengan pengujian antagonis isolat kapang endofit terhadap A. flavus melalui metode dual culture menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan tiga ulangan. Sebanyak 25 morfotipe isolat kapang endofit diperoleh dari tanaman pala dengan karakteristik makroskopis yang berbeda. Hasil uji antagonis terhadap pertumbuhan A. flavus diperoleh nilai rerata hambatan berkisar 49,21+2,81 – 80,11+1,54%. Uji keamanan 25 isolat kapang endofit yang mampu menghambat A. flavus didapatkan tiga isolat dengan sifat nonpatogen terhadap manusia, hewan dan tumbuhan. Ketiga isolat terpilih terdiri dari Db4P13A, Db2P21C (asal daging buah) dan Bj2P12D (asal biji) dengan aktivitas antifungi kuat, masing-masing kemampuan hambatnya 68,70%; 58,13%; dan 67,63%. Interaksi antagonisnya berupa mikoparasit (Db4P13A) dan antibiosis (Db2P21C dan Bj2P12D). Isolat Db4P13A, Db2P21C dan Bj2P12D masing-masing teridentifikasi sebagai Pseudopestalotiopsis camelliae-sinensis, Phomopsis sp. dan Nodulisporium sp.
Kata kunci: Aflatoksin; Aspergillus flavus; Kapang Endofit; Tanaman Pala; Uji Antagonis