Tanaman pala (Myristica fragrans Houtt.) merupakan salah satu komoditas unggulan Indonesia terutama pada bagian biji. Namun, biji pala pascapanen rentan terkontaminasi oleh Aspergillus flavus penghasil aflatoksin. Pengendalian A. flavus perlu dilakukan dengan memanfaatkan agen hayati khamir yang ramah lingkungan. Penelitian ini bertujuan untuk memperoleh isolat dan nama jenis khamir dari tanaman pala yang potensial sebagai agen antagonis terhadap A. flavus penghasil aflatoksin. Metode yang dilakukan yaitu isolasi khamir dari bagian biji, buah, dan daun pala kemudian diuji antagonis terhadap A. flavus penghasil aflatoksin secara dual culture. Hasil isolasi diperoleh 51 isolat khamir yang selanjutnya digunakan untuk uji antagonis. Hasil uji antagonis diperoleh 5 isolat khamir yang mampu menghambat pertumbuhan A. flavus dengan persentase hambatan yaitu DP 1342 (55,98%), DP 1341a (47,23%), DB 3341 (36,25%), BJ 1222 (23,75%), dan DB 1331 (17,50%). Hasil uji hemolisis dan uji hipersensitif menunjukkan kelima isolat khamir antagonis berpotensi non patogen pada mamalia dan berpotensi patogenik pada tanaman. Karakterisasi morfologi, bentuk sel, dan identifikasi molekuler menggunakan sekuens Internal Transcribed Spacer (ITS) dilakukan pada 2 isolat khamir antagonis terpilih berdasarkan persentase hambatan, yaitu DP 1342 dan DP 1341a. Hasil BLAST menunjukkan DP 1342 dan DP 1341a memiliki homologi masing-masing 99,84% dan 100% dengan Pseudozyma hubeiensis.
Kata kunci: Aspergillus flavus; Khamir antagonis; Myristica fragrans Houtt.; Pseudozyma hubeiensis