Tanaman karet (Hevea brasiliensis) merupakan komoditas penting yang memerlukan varietas unggul untuk menghadapi cekaman lingkungan. Kultur in vitro yang dikombinasikan dengan mutagen kimia Ethyl Methane Sulfonate (EMS) menjadi salah satu metode untuk meningkatkan variabilitas genetik. Penelitian ini bertujuan untuk menentukan Lethal Concentration 50 (LC50) EMS serta mengevaluasi pengaruh konsentrasi dan waktu perendaman terhadap morfologi kalus dan pembentukan embrio somatik. Penelitian dilakukan dalam dua tahap menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dan dianalisis dengan ANOVA dan uji Tukey taraf 5%. Tahap pertama menentukan LC50 dengan hasil konsentrasi 0,4% (3 jam) dan 0,33% (5 jam). Perlakuan EMS menyebabkan perubahan signifikan pada jumlah embrio somatik tetapi hanya terbentuk sedikit, volume signifikan didominasi kecil, dan warna kalus yang mencoklat, tetapi tidak berpengaruh nyata terhadap tekstur kalus yang didominasi kompak. Tahap kedua yaitu optimasi konsentrasi EMS pada 0; 0,01%; dan 0,05% dengan perendaman 0; 1;1,5 dan 2 jam, menunjukkan penurunan tingkat kematian kalus, jumlah embrio somatik yang meningkat dan berbeda nyata pada fase globular dan kotiledon, volume berbeda nyata didominasi kategori sedang, tekstur didominasi remah, serta warna kalus tetap kuning. Hasil ini menunjukkan bahwa perlakuan EMS dapat memengaruhi viabilitas kalus dan pembentukan embrio somatik.
Kata Kunci:Ethyl methane sulfonate (EMS);Induksi mutasi;Embrio somatik;Kalus