Puskesmas menghasilkan air limbah yang memiliki potensi cemaran Escherichia coli meskipun telah menggunakan Instalasi Pengolahan Air Limbah (IPAL). Oleh karena itu, diperlukan alternatif pengolahan air limbah berkelanjutan yang solutif, salah satunya menggunakan ekoenzim sebagai agen bioremediasi. Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis efektivitas ekoenzim dalam mengurangi jumlah bakteri E. coli pada air limbah di Puskesmas Rawa Tembaga Kota Bekasi. Penelitian ini adalah penelitian eksperimental menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan variasi konsentrasi ekoenzim (0%, 5%, 10%, 15%) sebanyak 6 kali pengulangan menggunakan metode membran filter serta dilakukan pengukuran parameter pendukung berupa pH, BOD5, COD, dan TSS. Penambahan ragi pada ekoenzim dilakukan untuk menghasilkan waktu fermentasi yang lebih efisien. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekoenzim berpengaruh nyata terhadap jumlah E. coli pada air limbah Puskesmas Rawa Tembaga ditandai dengan nilai signifikansi (P