Meningkatnya pertumbuhan ekonomi masyarakat menyebabkan kebutuhan energi semakin meningkat padahal ketersediaan energi mulai menipis. Biohidrogen (gas H2) merupakan salah satu sumber energi alternatif yang dihasilkan oleh mikrobia. Biohidrogen bisa didapatkan melalui proses fermentasi menggunakan Palm Oil Mill Effluent (POME) sebagai substrat. Bakteri fermentatif mengubah senyawa organik yang terkandung dalam POME menjadi senyawa yang lebih sederhana dan melepaskan hidrogen. Tujuan penelitian ini adalah untuk mempelajari pengaruh preculture inkubasi mikroba mix culture yang berasal dari lumpur aktif kolam anaerobik Pabrik Kelapa Sawit (PKS) Cikasungka dan mikroba mix culture biohidrogen dari Feng Chia University (FCU). Produksi gas diawali dengan perlakuan pretreatment kemudian dijadikan seed dan dilakukan variasi media preculture inkubasi 37℃ dan 55℃. Penentuan variasi preculture terbaik dilakukan berdasarkan fase pertumbuhan bakteri dalam fermentasi yang dibuktikan dengan gas hasil fermentasi. Variasi yang menghasilkan gas tertinggi selanjutnya dijadikan seed (benih) untuk produksi gas H2 secara kontinyu. Konsentrasi gas hidrogen diidentifikasi menggunakan GC-TDC. Hasil penelitian menunjukkan bahwa preculture dengan variasi glukosa + POME melalui sterilisasi menggunakan mikroba mix culture yang berasal dari lumpur aktif kolam anaerobik PKS Cikasungka menghasilkan produksi gas tertinggi dengan waktu 24 jam. Produksi hidrogen secara kontinyu tertinggi dihasilkan pada fermentasi kontinyu dengan Hidroulik Retention Time (HRT)18 jam yang menghasilkan gas hidrogen 108,56 ml/24 jam volume kerja 2.400 mL dengan penurunan COD 27,32 % dari COD awal 26.680 mg/L.