Biji pala (Myristica fragrans Houtt.) merupakan komoditas unggulan Indonesia. Namun, biji pala pascapanen rentan terkontaminasi oleh Aspergillus flavus penghasil aflatoksin. Pengendalian A. Flavus perlu dilakukan dengan memanfaatkan agen hayati BAL yang ramah lingkungan. Penelitian ini bertujuan untuk memperoleh isolat bakteri asam laktat (BAL) dari buah pala yang potensial sebagai agen antagonis terhadap A. flavus penghasil aflatoksin. Metode penelitian yang dilakukan yaitu isolasi BAL dari buah dan manisan buah pala dan kemudian diuji antagonis terhadap A.flavus dengan menggunakan metode dual culture assay. Hasil isolasi didapatkan sebanyak 30 isolat BAL dengan dengan masing-masing 24 isolat dari manisan buah pala dan 6 isolat dari buah pala. Tujuh dari tiga puluh isolat BAL dapat menghambat pertumbuhan A. flavus dengan persentase daya hambat yaaitu MPAB2 (4,06%), MPAD2 (4,00%), MPHC2 (3,95%), MPHE4 (10,02%), BPAG2 (36,95%), BPHG1 (25,78%), dan BPHG2 (42,19%). Uji hipersensitifitas pada tanaman tembakau menunjukkan 3 isolat dari 7 isolat BAL antagonis positif patogen terhadap tanaman, yaitu Isolat BPAG2, BPHG2, dan BPHG3. Uji hemolisis menunjukkan isolat (0%) tidak ada yang menunjukan hasil positif beta hemolisis atau aman terhadap mamalia. Identifikasi morfologi dan biokimia menunjukkan bahwa isolat MPAB2, MPAD2, MPHC2 dan MPHE4 diklasifikasikan sebagai genus Lactobacillus.
Kata kunci: Bakteri asam laktat antagonis; Lactobasillus; Myristica fragrans Houtt.