Biosurfaktan merupakan senyawa amfifilik yang dapat meningkatkan laju degradasi hidrokarbon. Mangrove Ambon dilaporkan telah terkontaminasi tumpahan minyak sehingga berpotensi dihuni bakteri penghasil biosurfaktan. Bakteri pendegradasi minyak bumi dari sedimen Mangrove Ambon Desa Nania (NNA) dan Tawiri (TWR) digunakan pada penelitian ini untuk produksi biosurfaktan. Penelitian ini bertujuan mendapatkan kondisi yang optimal untuk produksi biosurfaktan serta mendapatkan struktur molekul yang dihasilkan. Pseudomonas aestusnigri NNA 0-9 menjadi isolat dengan hasil skrining terbaik sehingga digunakan untuk tahap optimasi. Optimasi produksi biosurfaktan menggunakan metode self-directing optimization dengan Rancangan Acak Lengkap (RAL). Data optimasi dianalisis dengan ANOVA dan diuji lanjut dengan uji Duncan. Konsentrasi minyak zaitun sebagai sumber karbon dan pH berpengaruh meningkatkan indeks emulsifikasi (IE24) (p